?WesternBlotA.制胶
分子量越大，所用的胶浓度越低，蛋白电泳速度越快。浓缩胶[11]浓度均为5%。分离胶[10]选择：
凝胶浓度
蛋白大小：15%
12-4KD；10%
16-68KD；7.5%
6-94KD；5%
57-KD。
若上样体积小于10uL，玻璃板选用厚1mm（转膜更快），否则选用1.5mm，注意玻璃板底部要对齐。
清洗干净制胶的玻璃板并安装好模具，注入双蒸水检测是否漏液（导致非匀强电场）。
配置分离胶[10]8mL混匀后（胶液不可有沉淀，1mm胶板为5mL）灌入模具中至低玻璃板上缘下cm处（一般为梳子下缘1cm处，不要太高），然后在其上层注入一层双蒸水或95%酒精或异丙醇压胶（无水乙醇更多，挥发快），室温聚合40-60min。
倒去上层液体，吸水纸吸尽残余水分（不放入玻璃板内，边缘就好）。
配置浓缩胶[11]5mL混匀后用移液枪沿内侧玻璃板将其灌入到分离胶上层至低玻璃板上缘，迅速再两个绿色卡槽中间插入梳子（糙面向短板），确保梳齿下和梳齿间无气泡（后面可以补一点浓缩胶液），室温聚合40-60min。
胶板撒一些双蒸水，保鲜膜包裹4℃保存（2h后-d内使用，一般隔天用）。
安装电泳装置（短板朝内，长板朝外），加入电泳缓冲液[12]，内层液至高玻璃板上缘之间。
安装技巧：一首是指指腹按压厚玻璃板一侧上缘，拇指指腹按压薄玻璃板同侧上缘，两指向下按压的同时另一只手锁上同侧锁扣。
小心垂直向上拔梳子（左右同步拔），胶孔内若有未聚合凝胶颗粒或丝，需用注射器针头移除。
再加入电泳缓冲液[12]至溢出（外槽液两块胶到“2”标志，四块胶到“4”标志），将梳孔内气泡冲干净。
每孔加入40uL（总蛋白含量0ug，加之前一定要振荡），10uL（0.1mm孔，总蛋白含量15ug）蛋白样本。
B.电泳
连通能源，80V电泳25-0min（气泡从下往上走）至所有样本处于分离浓缩胶分界线上，V电泳60-65min至Loadingbuffer提示快跑出分离胶时，卸下并轻轻敲开玻璃板，小心剥离凝胶。（或者90V直接一直跑，会慢一些）
C.转膜（湿跑法）
两片海绵、滤纸和PVDF膜浸入预冷的TransferBuffer[1]中0min以上。
电泳结束，将凝胶（翘膜板要提前润湿，可在水里翘）浸入缓冲液（1XTAE）平衡5min，后将多余的凝胶切除。
取PVDF膜（一般为2x8cm，目标蛋白0kD以下用0.22um膜，以上用0.45um膜）按凝胶大小裁剪至合适大小（膜右上角剪个特异切口表示组别和方向）。
放于甲醇中浸泡15s（活化膜上正电基团，竞争SDS和蛋白的结合，张弓老师认为1s足够，实验室认为无关紧要），双蒸水2min，然后转入预冷的TransferBuffer[1]中平衡15min。
打开转印夹，按“电源红色正极-透明板-海绵垫-2层滤纸-PVDF膜-凝胶-2层滤纸-海绵垫-黑孔板-电源黑色负极”做好转膜三明治，每层注意用玻璃棒（滚筒）去除气泡，确保PVDF膜和凝胶对齐（一定一定要练习）。
膜可以用水笔或者铅笔做标记，区分正反。
将装置放入转印槽，加TransferBuffer至转印槽上相应水位低处，盖上盖子。
（转膜条件尽量查文献）
转膜时长和蛋白分子量有关，一般kb以内的蛋白，转膜时长1kb/1min，大于kb，改为1kb/1.5分钟。（另有说法一般60min，大于kD-min，彻底要过夜）
小分子蛋白（小于20kD）用0.22mm的PVDF膜转膜时间过长可能会转透，如真需（例如同胶有大分子要跑且裁胶不方便）可放两张膜。
转膜电一般是恒流mA，加冰袋；分子量大时，可用00mA，隔1h换1次冰袋（因为转膜过程会产生大量热量）。
Bio-rad的设置，设恒压V，观察电流，一块胶-mV，两块胶20-mV为正常，若超过则暗示缓冲液配错了或过热。（此为张弓老师观点，认为恒流发热严重，不宜采用）
转膜结束后用镊子从Marker面将PVDF膜取出，双蒸水中漂洗一次。
此时可用丽春红S染色观察是否转膜成功，TBS可洗去。
根据marker位置将目的蛋白和内参蛋白的所在膜区域剪开（膜置于培养皿下表面，盖上一层保鲜膜用刀片切，注意做标记区分正反和组别）。
D.封闭
目标蛋白膜用5%正常兔血清封闭，内参蛋白膜用5%脱脂奶粉[16]（过滤）封闭，摇床慢速（80-90r）2-h。
（磷酸化蛋白应该用%BSA，可以降低背景）（BSA效果较好，仅需1-2h）
某些抗体需要用特殊的封闭液（记得看说明书）
E.敷一抗
弃去封闭液，PVDF膜用TBST[15]漂洗（脱脂奶粉遍，BSA1遍）。
将膜放入杂交袋（膜宽小于8mm，可2条背对背置于15mL离心管中，mL液体；大于8mm，5格的抗体孵育槽，4mL液体）中，目标蛋白膜加相同封闭液稀释的一抗（孵育完的一抗可进行回收，一般可重复利用5-10次），摇床4℃冰箱过夜（转速至液面有明显晃动）。
一抗浓度一般去说明书稀释倍数的中间值，如1:0-1:00应该取1:，-20℃保存。
一抗标签：日期+抗体来源+目标蛋白或其基因+抗体公司名+稀释倍数
F.敷二抗
取出PVDF膜（条带），用TBST[15]洗涤次，5min/次。若抗体效价不是很好，可适当延长每次的洗涤时间（4次，10min）。
再用相同的封闭液稀释二抗，室温置于摇床上摇1h~1h0min。
之后取出条带再用TBST[15]洗涤-5次，5min/次，TBS[14]洗膜10min（以去除Tween20，也可不洗）。
G.显影
暗室中比例1:1配显影液（最好反应1min后），注意避光(可用锡箔纸)。
每条带（蛋白面朝下，镊子夹起晃动）滴约mL显影液，室温5min。
照胶仪内铺一张PE手套，取孵育好的PVDF膜，吸干多余显影液，将膜放到PE手套上，照胶仪曝片，保存（8-bits-tiff），数据分析。
点开序列拍摄，可调整灰度值和曝光时间（时间不是越长越好，会改变定量性和增加背景，ECL不超过5min）。
显影成像时因不同曝光时间会影响成像效果，最好尝试取欠曝光（可用图像处理软件处理）、适度曝光以及过度曝光（基本无用）等多个曝光时间，取差异最大的图像。
如果是发好的paper，建议将膜保留下来，注意保湿（可保存8～9个月），部分投稿杂志会要求作者提供
?图像处理
最备受推崇的定量分析软件QuantiyOne软件（昂贵）
图像处理软件ImageJ（免费简单）以此为例进行灰度和密度分析。
记得备份原图！！！
A.ImageJ对WB条带进行灰度分析
1）File
Open打开WB结果图片
2）图片类型设置：Image
Type
8bit
）去除图片背景：Process
SubtractBackground
在SubtractBackground窗口按照以下条件进行设置：
（一般为50，越小留黑越少）
4）设置定量参数：Analyze
SetMeasurements,点击Area，MeanGrayValue及IntegratedDensity
5）设置单位:Analyze
SetScale,在“unitoflength”的方框里输入“pixels”
6）将图片转换成亮带，Edit
Invert
7）选择FreehandSelection,尽量把条带圈起来，点击键盘m，出来IntDen灰度值
8）复制数据IntDen进行分析
9）保存为WB结果文件
B.ImageJ对WB条带进行密度分析
1）File
Open打开WB结果图片。
2）如果条带不正，需修正Image
transform
rotate调节angle值，直到条带水平为止。
）选中矩形选项，圈中第一个条带，Analyze
Gels
SelectFirstlane（快捷键Ctrl+1），双击矩形选中，然后Analyze
Gels
SelectSecondLane（快捷键Ctrl+2）创造下一个选区,移动到第二个条带上，之后依次类推，最后Analyze
Gel
Plotlanes。
4）选中直线工具，将开口的波峰关闭。选中魔棒工具，点击波峰可以显示波峰下面积，即条带的密度值，以第一个数值为基数，其他数值与第一个数值的比值即为相对密度。
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